源于肠道有益菌的高活性肝素酶I及其高水平基因工程表达生产
项目概况
肝素酶I在临床一线抗凝药低分子肝素的制备以及一些诊断分析中具有重要应用。本成果鉴定发现了肠道菌（多形拟杆菌）来源的肝素酶I，并结合AI分析对其进行了进一步的理性进化，获得了多个比目前产业化所用黄杆菌来源的肝素酶具有更高的活性和更强的稳定性的酶分子，并建立了其高效可溶性基因工程表达工艺。目前，已获得了3件授权发明专利。
应用前景
与传统肝素相比，低分子肝素具有更强的抗凝活性，但又很大程度地减小了出血的危险性，因此被广泛应用于临床抗凝治疗中。目前，低分子肝素的制备主要是通过化学法，但存在环保风险大、产物活性易受影响等缺点。生物酶解法可以很好的克服这些问题。目前市场所用肝素酶主要源自肝素黄杆菌（Pedobacter heparinus），通过基因工程方法生产，但其产量、酶活及稳定性均不甚理想，因此严重限制了酶法制备在低分子肝素生产中的应用（目前主要是亭扎肝素等品种使用酶解法）。
在国家重点研发计划、863等项目支持下，本研究通过基因工程技术，在人体肠道有益菌——多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）中鉴定并克隆了与肝素黄杆菌肝素酶具有较高同源性的新的肝素酶I基因（Bt-HepI），构建了其重组大肠杆菌生产菌株，确定了酶学性质，证实该肝素酶具有和工业所用肝素黄杆菌肝素酶I（Ph-HepI）相同的催化活性，但可溶性表达特性则显著优于Ph-HepI，比酶活是pH-HepI的2.05倍。在此基础上，我们进一步结合AI工具、应用分子动力学模拟技术对构效关系建议分析后，对酶分子进行了理性分子改造，使重组酶的可溶性表达量和热稳定性均显著提升（50℃半衰期进一步提升到野生型Bt-HepI的2.14倍）。进而，优化确定了工程菌表达的最佳条件，5 L发酵罐的酶活产量可达3.94×105 IU/L。
本成果的产量、活性及稳定性均高于目前工业用同类产品，且来源安全可靠，将在抗凝药物低分子肝素的制备、分析等领域具有很好的应用前景。低分子肝素相关药物的全球市场已超过130亿美元,且继续以年均10%左右的速度在增长。因此，本成果将具有非常好的社会经济价值。
技术特点
已形成了自主知识产权专利群，拥有系列不同性能的自主知识产权优良菌种，将为相关产品的研发提供有力的理论支撑和原料保障。
申请和授权专利
（1）罗学刚，张川，杨宝成，张同存. 一种比酶活提高的肝素酶I的定向改造酶及分子改造方法和表达工程菌. NO. ZL201811086711.X.
（2）罗学刚，张川，张同存, 刘耀天. 一种基于分子动力学的酶柔性分析提高肝素酶I热稳定性的突变体及其制备方法. NO. ZL201910052220.1.
（3）罗学刚，张川，张同存, 刘耀天. 一种通过增加二硫键提高肝素酶I热稳定性的突变体及制备方法. NO. ZL201910052337.X.
联系人：罗学刚
联系电话：13752007564
邮箱地址：luoxuegang@tust.edu.cn
