乳酰-N-四糖生物安全菌株发酵技术
项目概况
乳糖-N-四糖（LNT）作为1型HMOs的核心结构，是HMOs中最为丰富的组分之一。LNT具有调节肠道微生物群，防止病原体黏附，免疫调节作用等生理功能。LNT已被FDA列为“公认安全”的新型食品添加剂，批准作为功能性成分被商业化添加至婴幼儿配方奶粉中，也可应用在膳食补充剂和医疗食品领域。LNT已经引起了相当多的商业关注，其经济高效的工业化生物生产成为当前的研究热点。
应用前景
目前，添加HMOs的产品的主要目标人群仍是婴幼儿群体此外还有针对儿童和成人群体消化健康相关的膳食补充剂与功能性食品，产品主要为益生菌粉剂。此外，功能强化的饮料和酸奶、儿童食品等，也是重要的HMOs产品开发方向。
相关企业数据显示，2019年末国际婴儿配方奶粉市场消费量约为175万吨，其中含HMO的婴儿配方奶粉的消费量为5万吨，占比为2.9%。2019年末国内婴儿配方奶粉的市场消费量约为70万吨，占全球市场约 40%。产值约为1426亿人民币，较2018年同比增长6.9%。其中，含HMO婴儿配方奶粉2019年消费量为4750吨，占比为0.7%。
技术特点
在已知报道中，一直是大肠杆菌作为LNT的生产菌株。然而，大肠杆菌分泌内毒素，使它不是生产食品添加剂的理想菌株。鉴于对食品安全的广泛担忧，使用枯草芽孢杆菌生产LNT是一个更具吸引力的策略。
本项目中利用代谢工程与合成生物学策略首次在食品级安全菌株益生菌枯草芽孢杆菌中构建具有自主知识产权的高效生产LNT的重组菌株。首先，通过筛选高效表达的异源基因和优化表达条件，引入异源LNT生物合成途径，实现LNT的生物合成；然后，采用CRISPR-Cas9系统阻断代谢分支途径、强化前体物质合成途径和强化异源LNT合成途径，在枯草芽孢杆菌中构建高效生产LNT的底盘菌株；接着，通过引入异源可能的LNT转运蛋白CmSET和优化发酵培养基，解决菌株生长抑制问题，提高LNT产量；最后，构建经济高效的CRISPRi系统组合弱化与LNT合成途径竞争的生长必需途径，进一步提高LNT产量和底物转化率，降低LNT生产成本。
最终构建的工业菌株摇瓶发酵生产12.51g/L LNT；5L发酵罐LNT产率≥60 g/L，转化率≥0.41 g/g葡萄糖，生产强度≥1 g/(L*h)。在摇瓶水平和5 L发酵罐规模下的LNT合成能力均高于现有文献报道水平，为LNT工业化生产奠定基础。
授权专利
1.高伟霞，王春花，胡少茹．一种合成乳酰-N-四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用[P]．中国专利：CN202410892785.1，2024-11-15．
2.高伟霞，王春花，吴逸晨．一种提高枯草芽孢杆菌乳酰-N-四糖产量的CRISPR/dCas9载体及其构建方法和应用[P]．中国专利：202510124852X，2025-01-26．
联系人：高伟霞
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